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全长微生物多样性
三代微生物多样性是基于 PacBio 测序平台,利用单分子实时测序(SMRT Cell)的方法对 marker 基因进行测序,之后通过对 CCS(Circular Consensus Sequencing)序列过滤,得到 Optimization-CCS 进行 OTUs(Operational Taxonomic Units)聚类,并进行物种注释及丰度分析,可以揭示样品的物种构成; 进一步进行α多样性分析(Alpha Diversity)、β多样性分析(Beta Diversity)和显著物种差异分析等等,可以挖掘 样品之间的差异。
实验流程
测序原理
在一个反应管(SMRTCell: 单分子实时反应孔) 中有许多圆形纳米小孔, 即上面提到的 ZMW(零模波导孔) , 外径 100 多纳米, 比检测激光波长小(数百纳米) , 激光从底部打上去后不能穿透小孔进入上方溶液区, 能量被限制在一个小范围(体积 20*10-21L) 里, 正好足够覆盖需要检测的部分, 使得信号仅来自这个小反应区域, 孔外过多游离核苷酸单体依然留在黑暗中, 将背景降到最低。 单个 ZMW 底部固定有一个结合了模板 DNA 的聚合酶, 当加入测序反应试剂后, 每个碱基配对合成后会发出相应的荧光并被检测。 一个SMRTCell 中有 15 万个 ZMW, 每个孔中有一个单分子 DNA 链在高速合成。 原始检测数据的结果, 每合成一个碱基即显示为一个脉冲峰, 每分钟>100 个碱基的合成速度, 配上高分辨率的光学检测系统, 就能实时进行检测。
分析流程
肠道微生物多样性课程表
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