美吉生物

环境微生态 微生物多样性 16S/18S/ITS/功能基因多样性测序

16S/18S/ITS/功能基因多样性测序 生信分析 技术参数 案例解读 常见问题 留言咨询

        微生物多样性测序(又称扩增子测序)是利用二/三代测序平台,对16S rDNA/18S rDNA/ITS/功能基因等特定区段PCR产物进行高通量测序,突破传统微生物不可培养的缺点,获得环境样本中的微生物群落结构、进化关系以及微生物与环境相关性等信息。

适用范围

       1. 医学领域:常见疾病与人体微生物的关系;

       2. 动物领域:肠道、瘤胃(如产甲烷菌类群)与动物健康/营养消化研究等;

       3. 农业领域:根际微生物与植物互作、农业耕作/施肥处理与土壤微生物群落等;

       4. 环境领域:雾霾处理、污水治理、石油降解、酸性矿水处理及海洋环境等;

       5. 特殊极端环境:极端环境条件下的微生物类群研究。

美吉优势

       采用定向测序技术,避免了非定向测序造成的数据冗余,能充分利用每条有效序列,且便于后期的菌群分类处理。
       环境微生物群落多样性分析有 Illumina PE250/300 和 PacBio平台两种高通量测序平台可供选择,根据不同的测序要求提供不同的解决方案。
       业务方向多元化,可提供微生物与环境,微生物与农牧业及微生物与健康等多领域服务。
       众多成功案例,强大技术支撑、个性方案设计使美吉生物在微生物群落多样性测序及分析方面处于国内领先地位。
       美吉生物利用各组学技术为客户在微生物领域发表文章300+篇,其中宏组学文章10+篇,累计影响因子1000+。

实验流程


生信分析流程图

技术参数

送样要求

土壤:10 g;粪便:3-5 g;血液:10 mL;污泥:5-10 g

DNA:总量 ≥ 2 μg、浓度 ≥ 20 ng/μL1.8 < OD260/280 < 2.0

平台选择

 Illumina PE250/300PacBio平台

推荐测序量

土壤:2-3万;粪便:2-3万;肠粘膜:1-2万;胃液:1-2万;

水样:>1万;沉积物:>1万;皮肤表面:1-2



例一:珠江口不同生态梯度下浮游古菌群落结构的变化

       古细菌不仅仅存在于极端环境,在非极端环境如海水、淡水沉积物、土壤等环境中,古细菌也大量存在。珠江口是一个亚热带的河口,其上下游存在较大的环境因子梯度。本研究选取了珠江口上游三个淡水区域和下游三个海水区域作为采样点,使用454平台进行多样性测序,发现淡水区域与海水区域的优势菌群分别为MG-I和MG-II,盐度、溶解氧、营养盐和pH值是影响珠江口属于MG-I的古细菌分布的最主要因素。


图1 珠江口不同样品中古菌物种组成


图2 属于MG-I的古细菌的系统发育树

图3 属于MG-I的古菌物种与环境因子间的相关性分析图


案例二:一种用于低强度市政污水处理的新型电化学膜生物反应器的长期调研

       近年来,在低强度的污水治理中,一种新型的、低成本效应的电极-膜生物反应器(EMBR)面世。在该反应体系中,有机物质作为阳极的电子供体可以驱动阴极的反硝化作用。本研究选取活性污泥和碳刷生物膜样本,使用454平台进行多样性测序,低温条件下,Pseudomonas,Thauera等在硝化作用中占主导地位,而在高温条件下,脱氮菌Denitratisoma,Ottowia等在EMBR生物膜阴极上显著富集,其中一些微生物被认为在自养型反硝化作用中发挥着重要作用。此外,EMBR的活性污泥中反硝化菌的相对丰度(6.05%)显著高于CMBR活性污泥中反硝化菌的相对丰度(3.67%),表明新型的EMBR更容易融入到现有的污水治理设施中,提高污水治理质量、减轻膜污染、节约运营成本,实现污水治理的可持续性。



图1 低温(Group I)和高温(Group II)条件下微生物种群差异的LEfSe分析及不同温度条件下EMBR和CMBR的活性污泥和生物膜上反硝化菌的相对丰度比较


案例三:不同产毒素艰难梭菌感染对儿童粪便菌群的影响

       艰难梭菌相关性腹泻(CDAD)是由抗生素诱导的腹泻和结肠炎综合症。艰难梭菌能够产生高度耐药、可传播的芽孢,在抗生素治疗后能够定植肠道并出芽,从而导致艰难梭菌感染(CDI)。最新研究表明CDI已成为新生儿和儿童腹泻的常见病因,儿童发病率、复发率和死亡率明显升高。本文选取收集14个(CDAD A+B+)毒株感染儿童、23个(CDAD A-B+)毒株感染儿童、43个健康儿童的粪便,使用454平台进行多样性测序,健康儿童与CDAD儿童有明显的菌群差异,不同产毒艰难梭菌菌株(CDAD A+B+和CDAD A-B+)在门、目、科、属水平上也存在差异菌属,通过AUC曲线发现Enterococcus(肠球菌属)可以作为CDAD A+B+的诊断标签。


图1 不同儿童群体样品的PCA分析和热图聚类分析


图2 不同产毒艰难梭菌菌株与健康儿童之间的差异微生物分析。

 

参考文献

       [1] Liu J, Yu S, Zhao M, et al. Shifts in archaeaplankton community structure along ecological gradients of Pearl Estuary[J]. FEMS microbiology ecology, 2014, 90(2): 424-435.

       [2] Ma J, Wang Z, He D, et al. Long-term investigation of a novel electrochemical membrane bioreactor for low-strength municipal wastewater treatment[J]. Water research, 2015, 78: 98-110.

       [3] Ling Z, Liu X, Jia X, et al. Impacts of infection with different toxigenic Clostridium difficile strains on faecal microbiota in children[J]. Scientific reports, 2014, 4.

1分类学注释中,UnidentifiedNo_RankUnclassified等,分别是什么意思?


Unidentified

分类学比对时在设定的置信阈值以下reads或没有分类信息的reads

No_Rank

在某个分类学水平上没有明确的分类信息或分类名称。

Unclassified

在数据库中没有找到对应于该序列的分类信息

Others

自行定义,把丰度低于一定阈值的归到此项中


(2)PCAPCoANMDS的生物学意义及区别

       PCAPCoANMDS图都是反映样本间的差异和距离的,PCA是运用方差分解,将多组数据的差异反映在二维坐标图上,坐标轴为能够最大程度反映方差的两个特征值(主成分),如果样本组成越相近,反映在图中的距离越近。PCoA是通过一系列的特征值和特征向量进行排序,选择排在前几位的特征值,以此来描述和观察个体或群体间的差异。NMDS图是基于进化关系或数量距离矩阵,来描述样本间差异的。这三种图都是用于比较样本或样本组间差异的。通过样本点中的距离,体现样本间的差异程度。距离越大,差异越大。


(3)抽平分析是否为群落多样性分析中必需环节?是否可以增加群落组成分析的可靠度

       抽平是指按照一定数量或样本序列最低数量,将所有样本的序列随机抽取至统一数据量。抽平不是必须环节。抽平一般是指样品的数据量差别比较大,为了后续结果的一致性,需要对样品的测序量进行随机抽取(取最低条数或某一指定序列条数),然后进行后续分析。当样本之间的数据量相差较大时,抽平分析的结果在统计学上更具有意义,现在一些杂志的编辑在审稿时会要求对数据进行抽平分析。


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