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基因表达调控 转录组 真核有参转录组

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       有参考基因组的转录组研究,推荐选用Illumina测序平台,测得数据经过质控后mapping至参考基因组;对mapping到基因上的reads进行计数,计算基因的表达量后,进行基因表达差异及差异基因功能富集等分析。另外依据参考基因组,可进行诸如基因覆盖度、测序饱和度等验证性分析;可变剪切分析以及联合miRNA数据进行关联分析等高级分析。针对人、小鼠等模式生物,还可以进行蛋白网络构建等分析,深入研究基因功能,进一步揭示基因间互作网络等信息,为研究网络调控机理提供方向。


美吉优势

       美吉生物为您提供全面的转录组学研究方案。从样本制备、建库测序、生物信息学分析到后期数据解读,通过一站式的专业服务,让您更好地专注于科学研究。

       成熟、稳定的实验流程保障实验结果的可重复性;

       强大的超级计算平台搭配经验丰富的的生信分析专家团队;

       从实验方案设计到后期数据挖掘,全面助力您的科学研究。

技术路线




组织样品

       1.动物组织:>2g

       2.植物组织:>4g

       3.细胞培养:>1*107

       4.血液样品:≥2ml


RNA样品

       1.请提供浓度≥50ng/μL,总量≥2μg的RNA(单次建库用量为1μg),对于总量≥10ng的样本可以采用微量建库

       2.OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间,OD260/230≥2.0,RIN值≥6.5,28S:18S≥1.0,确保RNA无降解

       3.送样时请标记清楚样品编号,管口使用Parafilm膜密封

       4.样品保存期间切忌反复冻融

       5.送样时请使用干冰运输


cDNA样品

       1.样品需求量(单次):建议送样量≥2μg,对于总量≥500ng的样本可以采用风险建库

       2.样品浓度: 最低10ng/μL

       3.样品纯度:OD260/280介于1.80-2.00之间,RIN值≥6.5

       4.样品保存期间切忌反复冻融,送样时请使用干冰运输


实验周期

       1.样品制备:5个工作日完成RNA抽提及质检工作,将质检报告发送给甲方,待甲方确认后开始正式实验。(时间视具体样品数量及特点而定)

       2. Illumina HiSeq测序:乙方在获得甲方确认及收到预付款后25个工作日内完成测序工作。

       3.生物信息学分析:乙方在测序工作完成后25-35个工作日完成标准生物信息学分析。10-20个工作日完成高级生物信息学分析。(视具体工作量而定)

案例一

       油菜是世界三大植物油生产原料之一。油菜油脂主要储存在种子中,其主要成分是甘油三脂(TAG)和脂肪酸(FA)。在种子发育过程中多种基因参与调控,其中转录因子扮演重要角色,其不仅参与调控种子和胚芽发育,而且参与能量储备代谢,比如TAG合成和糖酵解途径等。本研究通过RNA-seq方法,整体研究油菜发育过程中基因的表达调控机理。

研究结果

(1)转录组测序数据分析

       转录组测序获得的reads总数为58,579,451条,每个发育阶段约20 million reads。所有reads中有78.37%比对上基因组(unique比对率为88.66%,mult-match比对率为11.34%),基因长度分布在100-2000 bp范围,约一半的基因长度在500-1500 bp之间。

 表1  油菜不同发育时期转录组测序数据统计

 表2  基因长度分布统计

  

 (2)不同发育时期差异基因分析

       比较分析17 DAP (BnEF17) vs 35 DAP (BnEF35)、35 DAP (BnEF35) vs 52 DAP (BnEF52)差异基因,针对差异基因进行GO和KEGG富集分析,发现三个发育阶段存在较大差异。

 

图1  油菜胚芽3个时期差异基因分析GO/KEGG注释

(3)差异表达的转录因子编码基因分析

       差异基因中有122个基因属于编码转录因子的基因,在油菜胚胎发育中分属于27个转录因子家族。其中11个差异转录因子编码基因参与种子发育和TAG合成途径,其在发育时期的17和35 DAP表现为高表达而52 DAP表现为低表达。其中2个差异转录因子编码基因在17 DAP高表达,而在35和52 DAP低表达。还有3个基因属于锌指蛋白家族,在17和52 DAP中低表达而在35 DAP中高表达。综上说明,差异表达的转录因子基因在脂肪酸代谢中发挥复杂的调控作用。

                                                       表3   参与脂肪酸代谢的差异表达的转录因子编码基因情况

 

 

图2   油菜胚胎发育中差异表达的转录因子编码基因分布

参考文献

Deng W, Yan F, Zhang XL et al., Transcriptional profiling of canola developing embryo and identification of the important roles of BnDof5. 6 in embryo development and fatty acids synthesis [J]. Plant and Cell Physiology, 56(2015): 1625-1640.


案例二:

       组蛋白去甲基化酶LSD2同时具有E3泛素连接酶活性,LSD2能够依赖其泛素连接酶活性促进O-GlcNAc糖基转移酶降解,从而抑制OGT引起的肿瘤细胞生长。LSD2能够直接对O-GlcNAc糖基转移酶进行泛素化,抑制A549肺癌细胞系生长。另外通过基因工程手段敲除LSD2,能够稳定OGT促进293T细胞的克隆形成。

重要结果

(1)利用免疫学实验方法同时结合基因工程手段研究LSD2功能

       组蛋白去甲基化酶LSD2具有E3泛素连接酶活性,同时经证实该酶直接作用的底物为糖基转移酶OGT。LSD2的E3泛素连接酶活性与它的组蛋白去甲基化酶是两种独立的酶活性。LSD2能够通过泛素化OGT使其降解,当一种蛋白酶体抑制因子MG132存在时,LSD2调控OGT降解的作用也会被阻断。

(2) LSD2抑制A549肺癌细胞的生长

       敲除LSD2基因后,293T-shLSD2细胞表现出肿瘤细胞成簇生长的特性 ,研究发现在癌细胞中LSD2的表达量低于293T细胞,尤其在A549肺癌细胞中的表达量最低。为了证实LSD2能够抑制肿瘤细胞的生长,对A549-Mock细胞以及A549 EV, LSD2, LSD24CA细胞进行结晶紫染色以及细胞生长曲线实验。结果表明A549-LSD2和A549-LSD24CA细胞克隆体数量明显低于A549-EV和A549-Mock细胞。

     

                               图1   敲除LSD2基因后促进293T细胞肿瘤发生(左图)和各细胞系中LSD2基因的表达量(右图)

(3)RNA-Seq技术发现LDS2可调控不同靶基因表达

       研究人员发现LSD2能够通过其去甲基化酶活性和E3泛素连接酶功能调控不同靶基因表达。进一步对差异表达基因进行GO注释发现,在A549-LSD24CA细胞中,LSD2可以参与steroid metabolic process(类固醇代谢), response to wounding(机体损伤应答), organ development(器官发育),cell growth(细胞生长),以及cell proliferation(细胞增殖)。而在细胞LSD2ER-AA中,LSD2则可以参与Wnt receptor signaling pathway(Wnt信号通路),stress reponse(应激反应),cell adhesion(细胞粘附)和immune response(免疫响应)。

                

                                             图2   差异表达基因聚类分析(左图)和差异表达基因功能富集(右图)

 

参考文献

Yi Yang, Xiaotong Yin, Huirong Yang,Yanhui Xu. Histone Demethylase LSD2 Acts as an E3 Ubiquitin Ligase and Inhibits Cancer Cell Growth through Promoting Proteasomal Degradation of OGT [J]. Molecular Cell. 2015


1.如何确定研究物种有无参考基因组?

       根据所研究物种的拉丁文名,可在JGI(http://genome.jgi-psf.org/)、Ensembl(http://asia.ensembl.org/index.html)、NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有该物种的基因组信息,也可在其他专门介绍某种物种的网站寻找参考基因组。 


2.是否一定要求设置生物学重复以及重复次数?

       目前没有生物学重复的实验发文章比较困难,尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后,遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费,无法设置生物学重复,那就得结合强有力的实验数据做支撑,比如定量实验、FISH荧光原位杂交或Northern blot等实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好,但是考虑到现实条件,重复设置≥3。一般不建议设置两个重复,因为如果两者结果不一致,我们无法确定以哪个数据为参考。

注:3个生物学重复,不等同于将3个样品的RNA等量混合后测序。3个样品等量混合测序,相当于将3个样本的基因表达量取平均值,其实就是相当于取了一个样本,由此得到的差异基因同样不可信,不能反应群体生物学现象。


3、真核核糖体RNA去除的话,去除率一般多高?和原核转录组去核糖体RNA的方法一样吗?

       和原核去除核糖体的原理是一致的,现在去除真核生物rRNA的kit也主要是Ribozero公司的,针对特异物种。根据长期项目经验,绝大多数真核生物去除rRNA的效率大于90%。

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