美吉生物

       无参考基因组的真核生物转录组项目使用Illumina测序平台，获得测序原始数据后，首先进行质控拼接，并进一步对拼接所得转录本进行功能注释、SNP、SSR标记开发等分析。在此基础上，也可以进行多个样本的差异基因表达分析和差异基因功能富集分析等，用于发现功能基因，为下一步研究提供方向。

美吉优势

       ★ 拥有标准化操作实验室和高通量测序技术平台，实验周期短，质量可靠。

       ★ 拥有Illumina HiSeq 2500、HiSeq 4000和MiSeq等多种高通量测序平台。

       ★ 技术人员经验丰富，可以根据合作伙伴要求提供实验方案、解决实验问题、分析实验结果。

       ★ 拥有专业的生物信息团队和大型计算机，可以为合作伙伴提供个性化的生物信息分析服务。

技术路线

组织样品

       1.动物组织：>2g

       2.植物组织：>4g

       3.细胞培养：>1*10⁷个

       4.血液样品：≥2ml

RNA样品

       1.请提供浓度≥50ng/，总量≥2μg的RNA（单次建库用量为1μg），对于总量≥10ng的样本可以采用微量建库

       2. OD260/ 280介于1.8 ~ 2.2之间 ，OD260/230≥2.0，RIN值≥6.5， 28S:18S≥1.0，确保RNA无降解

       3.送样时请标记清楚样品编号，管口使用Parafilm膜密封

       4.样品保存期间切忌反复冻融

       5.送样时请使用干冰运输

cDNA样品

       1. 样品需求量（单次）：建议送样量≥2μg，对于总量≥500ng的样本可以采 用风险建库

       2. 样品浓度：最低10ng/μL

       3. 样品纯度：OD260/280=1.80-2.00，RIN值≥6.5

       4. 样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输

案例一

       对感染过程中样品进行转录组研究是一种了解免疫机制的有效方法。本研究中，作者用草鱼呼肠病毒grass carp reovirus (GCRV)对草鱼进行感染，对病毒感染前后头肾及脾脏组织进行转录组测序，比较分析获得了217个显著的差异表达基因，对免疫相关基因进行表达分析。同时作者还发现了IL-12p40及IL-1R1的可变剪切产生的不同转录本在抗病毒免疫中具有不同的功能。

1. 转录组表达分析

       将四个文库（SS1, SR2, KS3,和KR4）与组装的转录组进行mapping。用Trinity软件进行预测，有54,609个unisequences (53.6%)为蛋白编码基因。文章进一步对转录组reads进行GO分类，注释到biological process（BP）, cellular component（CC）和molecular function（MF）的结果见图 1。

图1.C. Idella中GO term的分类和注释到生物过程、分子功能和细胞组分的分布

2.先天性免疫与获得性免疫相关基因差异表达分析

       为了研究GCRV感染草鱼后草鱼的免疫反应，对免疫相关的基因进行表达分析，共筛选出128个与免疫相关的基因。结果表明，先天免疫相关基因在脾脏中平均水平较高，说明脾脏中的免疫反应比肾脏中更强烈。在热图中(图 2-c)，KS3 和SS1文库聚集为一簇，KR4和 SR2文库聚集为另一簇，说明GCRV感染诱导的这128个基因的表达没有组织特异性。

图2. GCRV感染草鱼后其免疫相关基因的表达变化

3.草鱼的脾脏和肾脏中选择性剪接事件广泛存在

       分析表明有11811个unigenes (21.4%)有多个转录本，最少2个最多89个，可能发生选择性剪接。转录本发生差异表达的基因称为DETs。草鱼中有2782个DETs，占到unigene的5%。这些DETs参与免疫、核酸结合、化学修饰、pre-mRNA剪接以及其他生物学过程(图3)。

b: GCRV感染各个样品后表达变化转录本的维恩图。

参考文献

Wan Q, and Su J. Transcriptome analysis provides insights into the regulatory function of alternative splicing in antiviral immunity in grass carp (Ctenopharyngodon idella). Sci. Rep. 5, 12946; doi: 10.1038/srep12946 (2015).

案例二

       欧洲红蜘蛛是农场中最主要的害虫之一，杀螨剂-螺螨酯能够有效将其杀死。现阶段该物种已经对杀虫剂产生耐药性，但其耐药机制尚不明确。本文通过链特异性（无参）转录组测序方法，获得了螺螨酯敏感和抗性蜘蛛转录组的全面信息。将样品中解毒酶家族、杀螨剂作用靶点以及植物螨和杀虫剂抗性水平转移基因等进行注释（图1）。此外，利用差异基因分析，揭示了螺螨酯敏感和抗性蜘蛛中抗性基因的表达差异。该结果为进一步研究欧洲红蜘蛛对螺螨酯类杀虫剂的耐药机制提供了突破点（图2）。

图2 杀螨剂抗性和敏感的欧洲红蜘蛛基因表达差异分析

参考文献

Sabina B, Wannes D, Robert G,et al. Transcriptome profiling of a spirodiclofen susceptible and resistant strain of the European red mitePanonychus ulmi using strand-specific RNA-seq [J].BMC Genomics, 2015, 16: 974.

（1）如何确定研究物种有无参考基因组？

       根据所研究物种的拉丁文名，可在Ensembl（http://asia.ensembl.org/index.html） 、JGI(http://genome.jgi-psf.org/ )及NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中搜索是否有该物种的基因组信息， 也可在其他专门介绍某种物种的网站寻找参考基因组。

 （2）是否一定要求设置生物学重复，以及重复次数？

       目前没有生物学重复的实验发文章比较困难，尤其是IF≥5的杂志。文章投出之后，容易遭编辑质疑。如果确实受限于研究经费，无法设置生物学重复。那就要结合强有力的实验数据做支撑，比如定量实验、 FISH荧光原位杂交或Northern blot等，用实验数据说服编辑。重复设置原则上越多越好，但考虑到现实条件，重复设置≥3。一般不建议设置两个重复，因为如果两者结果不一致，我们无法确定以哪个数据为参考。 

（3）多个样品的转录组，如何确定是将所有样品一起拼接还是每个样品分开拼接？

       样品分开拼接的情况，一般适用于不同的物种，同一属不同的种或者同一物种不同的品系。通过分析同源基因受选择压力情况从而鉴定亲缘关系。

       同一物种不同个体的混样，或者同一个体不同组织部位，发育阶段样品建议一起拼接能够得到该物种更全的转录组数据。

 （4）真核生物以转录组de novo结果作为reference进行表达谱测序是否可行？

       可以的，但是因为转录组具有时空和组织特异性，需要保证表达谱测序样本要包含在转录组测序中，否则此reference没有意义。